ปฏิกิริยา อธิบายและทำความเข้าใจเกี่ยวกับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

ปฏิกิริยา ลูกโซ่โพลีเมอเรส การตรวจหาสารพันธุกรรมเป็นวิธีการทดลองทางอณูชีววิทยา ซึ่งเป็นการขยายเฉพาะของกรดนิวคลีอิกที่เกิดจากไพรเมอร์สังเคราะห์ โอลิโกนิวคลีโอไทด์ในหลอดทดลอง แนวคิดในการพัฒนาวิธี การตรวจหาสารพันธุกรรมเป็นของนักวิจัยชาวอเมริกันซึ่งในปี 1983 ได้สร้างวิธีการที่ทำให้สามารถขยายสารพันธุกรรมได้ ในระหว่างการทวีคูณของวัฏจักรโดยใช้เอนไซม์ สารพันธุกรรมพอลิเมอเรสภายใต้สภาวะประดิษฐ์

ในปี 1993 ได้รับรางวัลโนเบลสำหรับแนวคิดนี้ ในช่วงเริ่มต้นของการใช้วิธีการ หลังจากรอบการให้ความร้อนและความเย็นแต่ละครั้ง ต้องเติมสารพันธุกรรมพอลิเมอเรสลงในส่วนผสมของปฏิกิริยา เนื่องจากถูกปิดใช้งานอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูง ขั้นตอนไม่มีประสิทธิภาพมากต้องใช้เวลาและเอ็นไซม์เป็นจำนวนมาก ในปีพ.ศ. 2529 ได้มีการดัดแปลงสารพันธุกรรมพอลิเมอเรส จากแบคทีเรียที่ชอบความร้อนอย่างมีนัยสำคัญ เอ็นไซม์เหล่านี้สามารถทนต่อรอบปฏิกิริยาได้หลายรอบ

ซึ่งช่วยให้คุณทำ การตรวจหาสารพันธุกรรมได้โดยอัตโนมัติ หนึ่งในสารพันธุกรรมพอลิเมอเรสที่ทนต่อความร้อนที่ใช้กันมากที่สุดถูกแยกได้จาก แบคทีเรียเทอร์มัสอควาติคัสและชื่อ Taq-สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส สาระสำคัญของวิธีการ วิธีการนี้ใช้การคัดลอกแบบคัดเลือกหลายครั้งของบริเวณ DNA ที่แน่นอนโดยใช้เอนไซม์ Taq-สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส ปฏิกิริยา ลูกโซ่โพลีเมอเรสทำให้สามารถรับแอมพลิฟายเออร์ ความยาวเบสได้ถึงหลายพันคู่

เพื่อเพิ่มความยาวของผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรมเป็น 20 ถึง 40,000 คู่เบส ใช้ส่วนผสมของโพลีเมอเรสต่างๆ แต่ก็ยังน้อยกว่าความยาวของสารพันธุกรรม โครโมโซมของเซลล์ยูคาริโอตมาก ปฏิกิริยาจะดำเนินการในเทอร์โมสตัทที่ตั้งโปรแกรมได้ ซึ่งเป็นอุปกรณ์ที่สามารถทำงานได้เร็วพอ การทำความเย็นและความร้อนของหลอดทดลอง โดยปกติจะมีความแม่นยำอย่างน้อย 0.1 องศาเซลเซียส แอมพลิฟายเออร์ช่วยให้คุณตั้งค่าโปรแกรมที่ซับซ้อนได้

รวมถึงโปรแกรมที่มีความเป็นไปได้ที่จะเริ่มต้นแบบด่วน และที่เก็บข้อมูลในภายหลัง สำหรับการตรวจหาสารพันธุกรรมแบบเรียลไทม์ จะมีการผลิตอุปกรณ์ที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับเรืองแสง เครื่องมือยังมีให้พร้อมฝาปิดอัตโนมัติและช่องใส่ไมโครเพลท ซึ่งช่วยให้สามารถรวมเข้ากับระบบอัตโนมัติได้ โดยปกติในระหว่างการตรวจหาสารพันธุกรรมจะดำเนินการ 20 ถึง 45 รอบซึ่งแต่ละขั้นตอนประกอบด้วยสามขั้นตอน การทำให้เสียสภาพ การหลอมไพรเมอร์ การยืดตัว

การเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิในหลอดทดลอง ระหว่างวงจรการตรวจหาสารพันธุกรรม ในระยะต่อไปการยืดตัว การสังเคราะห์สารพันธุกรรมของลูกสาวจะเกิดขึ้นบนเมทริกซ์ของแม่ อุณหภูมิการยืดตัวขึ้นอยู่กับพอลิเมอเรสโพลิเมอเรส สารพันธุกรรมของ Taq และ Pfu ที่ใช้กันทั่วไปมีปฏิกิริยามากที่สุดที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เวลาการยืดตัวซึ่งส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับความยาวของผลิตภัณฑ์ การตรวจหาสารพันธุกรรมโดยทั่วไปคือ 1 นาทีต่อ 1,000 คู่เบส

หลังจากการตรวจหาสารพันธุกรรมตัวอย่างจะถูกฟักที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ปริมาณของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาจำเพาะจำกัดโดยไพรเมอร์ที่ประสิทธิภาพ 100 เปอร์เซ็น ในทางทฤษฎีจะเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณตามสูตร P=2n โดยที่ P คือปริมาณของผลิตภัณฑ์จำเพาะและ n คือจำนวนรอบของปฏิกิริยา ในทางปฏิบัติประสิทธิภาพของการตรวจหาสารพันธุกรรมน้อยกว่า 100 เปอร์เซ็น ดังนั้นในความเป็นจริงP= (1+E)n โดยที่ P คือปริมาณของผลิตภัณฑ์

ประสิทธิภาพรอบเฉลี่ยและ n คือจำนวนรอบปฏิกิริยา ด้วยมากกว่าที่ระบุไว้จำนวนรอบของปฏิกิริยา คือการสะสมของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงของรุ่นหลัง การเติบโตของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการแบบทวีคูณ ซึ่งถูกจำกัดโดยจำนวนของรีเอเจนต์ การมีอยู่ของสารยับยั้งและผลพลอยได้ของปฏิกิริยา ในรอบที่แล้วการเจริญเติบโตช้าลงซึ่งเรียกว่าปรากฏการณ์ที่ราบสูง จลนพลศาสตร์ การตรวจหาสารพันธุกรรมเป็นแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลในระยะเริ่มต้นเท่านั้น

หลังจากนั้นที่ราบสูงเริ่มต้นขึ้น เนื่องจากปฏิกิริยาของส่วนประกอบลดลง dNTPs,ไพรเมอร์และความเสียหายจากความร้อนที่เพิ่มขึ้นต่อพอลิเมอเรส Taq-สารพันธุกรรม ซึ่งเป็นการแข่งขันสำหรับเอนไซม์แอมพลิคอน ส่วนประกอบของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ส่วนประกอบที่ใช้ใน การตรวจหาสารพันธุกรรม มีดังต่อไปนี้ Taq-สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต,สารละลายบัฟเฟอร์,ไพรเมอร์และการย้อนกลับ

รวมถึงเทมเพลต สารพันธุกรรมเอนไซม์แทค-สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม ส่วนผสมของปฏิกิริยา การตรวจหาสารพันธุกรรม 50 ถึง 100 ไมโครลิตรจะมีเอนไซม์ในปริมาณ 0.5 ถึง 2 หน่วยต่อตัวอย่าง Taq-สารพันธุกรรมพอลิเมอเรส สังเคราะห์สาย สารพันธุกรรมได้มากถึง 1,000 คู่เบสต่อนาที โดยการเพิ่มเวลาการเกิดพอลิเมอไรเซชัน และการเลือกสายพันธุ์ใหม่ของสารพันธุกรรมพอลิเมอเรส ซึ่งมีกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส

การแก้ไขด้วยโดยการตัดนิวคลีโอไทด์ที่ผิดพลาดออก จึงเป็นไปได้ที่จะได้รับมาก ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต dNTPs ที่ใช้ในการตรวจหาสารพันธุกรรมมีดังต่อไปนี้ dATP,dGTP,gTTP,dCTP dNTP มีอยู่ในของผสมของปฏิกิริยาที่ความเข้มข้นเทียบเท่า 200 ถึง 500 ไมโครเมตร เนื่องจากส่วนเกินของพวกมันจะเพิ่มการจับคู่เบส ไพรเมอร์ความจำเพาะของการตรวจหาสารพันธุกรรม ขึ้นอยู่กับการก่อตัวของคอมเพล็กซ์เสริมระหว่างเทมเพลต

ไพรเมอร์แต่ละอันหลังเป็นส่วนเสริม ของหนึ่งในสายโซ่ของเทมเพลตแบบสองเกลียว กำหนดกรอบจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของขอบเขตที่ขยาย เนื่องจากไพรเมอร์จะถูกใส่เข้าไปในชิ้นส่วนที่ขยายได้ของเทมเพลตดีเอ็นเอแต่ละครั้ง ไพรเมอร์จึงต้องมีอยู่ในส่วนผสมของปฏิกิริยา การตรวจหาสารพันธุกรรมมากเกินไป และความเข้มข้นของไพรเมอร์คือ 0.5 ถึง 1 ไมโครโมลาร์

บทความที่น่าสนใจ : รอยฟกช้ำ ความผิดปกติที่เกิดจากการแข็งตัวของเลือด